Exercícios Fosforilação oxidativa

1. Resuma a teoria quimiosmótica. Qual a importância?

R- A teoria sugere essencialmente que a maioria da síntese de ATP na respiração celular seja proveniente do gradiente electroquímico formado entre os dois lados da membrana interna mitocondrial ao utilizar a energia do NADH e FADH2, formados no catabolismo de moléculas como a glicose.

Explanação do processo: Determinadas moléculas, tais como a glicose, são metabolizadas

de forma a produzir acetil-CoA, um intermediário energeticamente rico. A oxidação do acetil-

acoplada à redução de moléculas transportadoras como o NAD e o FAD. 2

Estas moléculas transportam elétrons para a cadeia de transporte eletrónico na membrana mitocondrial interna. A energia eletrônica é utilizada para bombear protons da matriz através da membrana mitocondrial interna, armazenando energia sob a forma de um gradiente eletroquímico transmembranar. Os protões passam então novamente para dentro da matriz através da ATP sintase. O fluxo de protões através desta enzima fornece a energia necessária para a fosforilação do ADP a ATP. Os elétrons e prótons que passam através da última bomba protônica da cadeia são adicionados ao oxigénio, formando água (na respiração aeróbia) ou outra molécula aceitadora de elétrons.

2. De que maneira os elétrons do NADH são transportados até a matriz mitocondrial?

R- As moléculas com alto potencial energético NADH e FADH2 são produzidas no ciclo dos ácidos tricarboxílicos e na glicólise. Estas moléculas transferem electrões para uma cadeia de transporte electrónico de forma a criar um gradiente de protões entre a membrana mitocondrial interna e a matriz mitocondrial; a ATP sintase usa então quimiosmose para sintetizar ATP. Este processo é denominado fosforilação oxidativa por o oxigénio ser o aceitador final de electrões na cadeia de transporte electrónico mitocondrial.

3. Como funciona o translocador de ATP-ADP?

R- A maior parte do ATP gerado na matriz mitocondrial por meio da fosforilação oxidativa é utilizado no citosol. A membrana mitocondrial interna contém um translocador de ADP-ATP (também chamado adenina-nucleotídeo-translocase) que transporta o ATP para fora da matriz em troca de ADP produzido no citosol pela hidrólise do ATP.
O translocador ADP-ATP, um dímero de subunidades idênticas de 30KD, possui um sítio de ligação pelo o qual ADP e ATP competem. Esse translocador possui duas conformações principais: uma, com o sítio de ligação ao ATP-ADP para o lado de dentro da mitocôndria, e o outro, com esse mesmo sítio, para o lado externo. O translocador deve unir-se ao ligante para alterar de uma conformação para outra, em uma taxa fisiologicamente razoável.

4. Resuma as etapas da cadeia transportadora de elétrons do NADH ao oxigênio.

R- Na reação completa catalisada pela cadeia respiratória mitocondrial, os elétrons se movem do NADH, succinato ou algum outro doador primário de elétrons através das flavoproteínas, ubiquinona, proteínas ferro-enxofre, citocromo e finalmente para o O₂.

5. Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa são o mesmo processo? Explique.

R- A fosforilação oxidativa é o processo metabólico de síntese de ATP a partir da energia liberada pelo transporte de elétrons na cadeia respiratória. Todo o processo depende de dois fatores, a energia livre obtida do transporte de elétrons e armazenada na forma de gradiente de íons hidrogênio e uma enzima transportadora denominada ATPsintase.

Também denominada de cadeia transportadora de elétrons, realiza o transporte de átomos de hidrogênio energizados, ou seja, elétrons, a partir de substâncias aceptoras intermediárias (NAD e FAD) provenientes da glicólise e do ciclo de Krebs.

6. Indicar a localização celular da cadeia de transporte de elétrons.

R- Cadeia respiratória é a etapa da respiração celular que ocorre no interior das mitocôndrias, precisamente em sua membrana interna pregueada.

7. Esquematizar a sequência dos compostos da cadeia transportadora de elétrons, indicando os transportadores sobre de elétrons e os transportadores de elétrons e prótons.

R-O processo de transferência de elétrons que conecta essas reações parciais, ocorre através de um caminho complexo que culmina com a liberação de energia livre na forma de ATP (Adenosina Trifosfato). Os 12 pares de elétrons envolvidos na oxidação da glicose não são transferidos diretamente ao O₂. Antes, eles são transferidos para as coenzimas NAD⁺ (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo) e FAD (Flavina adenina Dinucleotídeo) para formar 10 NADH + 2 FADH₂ nas reações catalisadas pelas enzimas glicolíticas e enzimas do ciclo do ácido cítrico. Os elétrons passam, então, para uma cadeia transportadora de elétrons onde, através da reoxidação do NADH e FADH₂, participam de redução-oxidação de cerca de 10 centros redox até reduzir O₂  em H₂O. Nesse processo, prótons são liberados da mitocôndria. A energia livre estocada no gradiente de pH resultante leva à síntese de ATP a partir de ADP e P_i através da Fosforilação Oxidativa. A reoxidação de cada NADH resulta na síntese de 3 ATPs, e a reoxidação de FADH₂produz 2ATPs, resultando em um total de 38 ATPs para cada glicose completamente oxidada a CO₂ e H₂O (incluindo ATPs produzidos na glicólise e 2 ATPs produzidos no ciclo do ácido cítrico).

Os NADH e FADH₂ produzidos na oxidação da glicose e de outros substratos são 

reoxidados na mitocôndria por um processo que compreende a remoção de seus prótons e

 elétrons: os prótons são liberados no meio e os elétrons são conduzidos por uma série de 

transportadores de elétrons até o oxigênio. Recebendo elétrons, o oxigênio liga-se a prótons

 do meio formando água. Cada um dos transportadores é capaz de receber elétrons do

 transportador imediatamente anterior e transferi-los ao seguinte, constituindo assim uma

cadeia chamada cadeia transportadora de elétrons.

O doador de elétrons é, invariavelmente, uma coenzima reduzida, e o aceptor final de elétrons, o oxigênio. A maioria dos transportadores de elétrons tem natureza protéica, contendo grupos prostéticos associados à cadeia polipeptídica; a óxido-redução do composto se processa no grupo prostético.

8. Citar três inibidores da cadeia de transporte de elétrons, indicando os transportadores sobre os quais atuam.

R- A transferência pode se dar de três formas: Direta, como átomo de hidrogênio (H⁺ + 1elétron), ou como íon hidreto - H^- (H⁺ + 2 elétrons).

O NADH+ e o FADH₂ transportam os elétrons de diferentes vias até a CTE, onde os doam

 Dentro da cadeia, o fluxo se estabelece entre uma série de transportadores que incluem

: carreadores de membrana (como as quinonas), citocromos e proteínas ferro-sulfonadas.

-Ubiquinona- singularmente, sua redução pode se dar em duas etapas diferentes:

• Recebe o 1º elétron, sendo reduzida a radical semiquinona - UQH
• 2º elétron - Ubiquinol - UQH₂

Desta forma, a ubiquinona pode fazer a interação entre doadores de 2 elétrons e receptores

 de um único.

Citocromos - são proteínas contendo ferro, portanto um grupo heme, responsável pelas

 diferentes variações: citocromos a, b e c. Enquanto a e b são proteínas de membrana, o 

c está "preso" à superfície externa da membrana interna por interações eletrostáticas.

Proteína Fe-S - são boas doadoras de elétrons, e transferem apenas um.

Complexo I: NADH à Ubiquinona

Equação geral:  NADH + H⁺ + UQ         NAD⁺ + UQH₂

A entrega não é direta, passando por FMN (Flavina MonoNucleotídeo), que entrega os

 elétrons à Fe-S ao qual está associada, e só então estes são entregues à UQ.

Complexo II: Succinato à Ubiquinona

A enzima responsável pela oxidação do succinato (a succianato desidrogenase), é a única do

 Ciclo do Ácido Cítrico ligada à membrana interna da mitocôndria e é através dela que 

os elétrons são doados ao FAD, para daí serem entregues à UQ via Fe-S. Este complexo não 

é responsável pelo bombeamento de nenhum próton para o espaço intermembrana. Assim

, os elétrons que chegam à CTE via FADH₂ só serão responsáveis pelo bombeamento de

 prótons a partir do complexo III, daí a síntese de 1ATP a menos pelo FADH₂ em comparação

 ao NADH+

.

Complexo III: Ubiquinona ao Citocromo c A Ubiquinona pode movimentar-se ao longo da

 bicamada lipídica. Assim, após receber elétrons a partir de qualquer um dos complexos

 anteriores, caminha até o complexo III, responsável por recebê-los e repassá-los ao

 citocromo c. A UQH₂, entretanto, só doará um elétron por vez ao cit c, o outro será doado a

 um cit b no complexo, que o devolverá à UQ, estabelecendo um ciclo em que se repetem

 estas etapas: UQH recebe um elétron do complexo I ou II mais 1H+ da matriz. A UQH₂ assim

 formada libera 1H+ para o espaço intermembrana e um elétron para o cit b. A UQH resultante

 libera outro H+ e doa um elétron ao cit c. A UQ recebe de volta um elétron do cit b e 1H+ da

 matriz

.

Complexo IV - redução do O₂

O citocromo c é livre para movimentar-se na superfície externa da membrana, levando assim

 os elétrons recebidos do complexo III ao IV. Só o fará, entretanto, quando houver acumulado 4

 elétrons. Neste complexo, os elétrons após passarem pelos cit a e a3, serão doados a 4H+ e

 1O₂ da matriz, sintetizando assim duas moléculas de água.

9. Qual seria o estado de oxidação (oxidado/reduzido) dos componentes da cadeia de transporte de elétrons em presença de malato e de antimicina A?

R-O malato, ao entrar na mitocôndria, traz consigo uma molécula de glutamato. O glutamato e o malato são transformados por uma amino-transferase, gerando α-ceto-glutarato e aspartato. Outra amino-transferase transformará o α-ceto-glutarato e o aspartato em malato e glutamato de novo, reiniciando o ciclo da lançadeira malato-aspartato. Na presença de antimicina temos a inibição da cadeia respiratória (transporte de elétrons). Por consequência as vias de metabolismo que dependem do oxigênio estão desativadas: ciclo de Krebs e beta-oxidação ( não há reoxidação das coenzimas reduzidas), funciona apenas a glicólise anaeróbica ( glicose lactato), produzindo 2 moléculas de ATP por molécula de glicose).

10. Definir fosforilação oxidativa.

R- A fosforilação oxidativa é o processo no qual só elétrons liberados durante a oxidação de substratos são transferidos para a cadeia mitocondrial transportadora de elétrons através de coenzimas reduzidas (NADH e FADH²) para o oxigenio molecular. A energia livre promove a sintese de ATP a partir de ADP.

11. Descrever a hipótese do acoplamento quimiosmótico para a fosforilação oxidativa.

R- A hipótese amplamente aceita hoje foi descrita por Peter Mitchell, em 1961, e é chamada "Hipótese Quimiosmótica de Mitchel", segundo a qual as condições para que ocorra a fosforilação oxidativa são: um bombeamento de prótons pela cadeia respiratória, criando um fluxo da matriz para o citosol e uma membrana mitocondrial interna (MMI) impermeável a prótons e íntegra.
A partir desta situação, são previstos os seguintes eventos na MMI:
- a cadeia respiratória, ao transportar os elétrons, bombeia prótons da matriz para o citosol;
- a MMI, por ser impermeável a prótons, impede o retorno destes à matriz;
- cria-se um gradiente duplo (de pH e eletrostático) através da MMI, que gera uma situação de alta instabilidade e, por conseqüência, uma força que atrai os prótons de volta;
- essa força, chamada força próton-matriz, dirige o refluxo de prótons à matriz mitocondrial através dos canais de prótons da enzima ATPase;
- a passagem dos prótons pela ATPase determina a síntese do ATP.

Como elementos que são suporte experimento à teoria de Mitchell, temos:
- não existe nenhum intermediário rico em energia na Cadeia Respiratória
- a fosforilação oxidativa requer uma MMI intacta
- a MMI é impermeável a prótons e outros íons como Cl- OH- e K+.
- a fosforilação oxidativa pode ser inibida por agentes ionóforos (transportadores de íons) e desacopladores (transportadores de H+ através da MMI)
- o fluxo de elétrons na cadeia respiratória ejeta prótons da matriz mitocondrial para o citosol da célula.

12. Indicar o número de ATP sintetizados para cada NADH e FADH₂ oxidados.

R- Rendimento energético: Para cada molécula de NADH oxidados, a quantidade de H+ ejetados permite sintetizar 03 moles de ATP. Já para cada mol de FADH2 oxidado, a quantidade de H+ ejetados permite sintetizar 02 moles de ATP.

13. Comente sobre as mitocôndrias desacopladoras do tecido marrom.

R- A maioria do mamíferos (incluindo homens e recém-nascidos) possuem o tecido adiposo marrom no qual a oxidação dos combustíveis não funciona para a produção de ATP, mas sim de para produzir calor (manter RN’s e mamíferos hibernantes aquecidos). Este tecido é marrom porque possui uma grande quantidade de mitocôndrias e, por tanto, grande quantidade de citocromos cujos grupos hemes são fortes absorventes da luz visível. As mitocôndrias do tecido adiposo marrom oxidam combustíveis (ácidos graxos), passando os elétrons através da cadeia respiratória até o O2. Esta transferência de elétrons é acompanhada pelo bombeamento de prótons para fora da matriz. Entretanto, a mitocôndria do tecido adiposo marrom possui apenas a termogenina (também chamada de proteína desacopladora) em sua membrana interna. Esta proteína desacopladora fornece uma rota alternativa para os prótons reentrarem na matriz mitocondrial, fazendo com que a energia conservada pelo bombeamento dos prótons seja dissipada como calor

14.A membrana interna da mitocôndria é impermeável à ATP e NADH. Mostrar como:

a) o NADH produzido na via glicolítica pode ser oxidado na cadeia respiratória (lançadeiras malato e do glicerol-fosfato);

R- O NADH produzido na via glicolítica pode ser oxidado na cadeia respiratória (lançadeira malato e do glicerol-fosfato);

Sistemas circulares especiais transportam os equivalentes redutores do NAD citosólico para dentro da mitocôndria por uma rota indireta. O circuito NADH mais ativo, que funciona nas mitocôndrias do fígado, rim e coração, é o circuito malato aspartato. Os equivalentes redutores do NADH citosólico são primeiro transferidos ao oxaloacetato citosólico produzindo malato, pela ação malato desidrogenase citosólica. O malato, formado desta forma, passa através da membrana interna para a matriz utilizando o sistema de transporte malato-α-cetoglutarato. Dentro da matriz, os equivalentes redutores são passados pela ação da malato desidrogenase matricial ao NAD+ da matriz, formando NADH; este NADH pode então transferir seus elétrons diretamente à cadeia respiratória na membrana interna. Três moléculas de ATP são geradas à medida que esse par de elétrons passa ao O2. O Oxalatocetato citosólico deve ser regenerado através da reação de trasaminação e a atividade dos transportadores de membrana começa um outro circuito. No músculo esquelético e no cérebro ocorre o circuito do glicerol-3-fosfato que, diferentemente do circuito malato-aspartato, libera os equivalentes redutores do NADH no Complexo III, e não no Complexo I, o que fornece energia apenas para a síntese de duas moléculas de ATP por par de elétrons.

b)o ATP produzido na mitocôndria pode ser utilizado no citosol.

R- O gradiente eletroquímico além de favorecer a síntese de ATP, ele também auxilia no transporte de moléculas para o interior da matriz mitocondial. A molécula de ATP que é produzida dentro da matriz mitocondrial tem que ser exportada para o citosol, como as moléculas de ADP e PI devem ser importadas para o interior da matriz mitocondrial para que a síntese de ATP possa continuar. O mecanismo de transporte de ATP para fora da célula e ADP e Pi para dentro é medido por uma proteína integral chamada de “translocador de nucleotídeo de adenina”. Como o ATP possui mais carga negativa do que o ADP, a troca é impulsionada pelo gradiente eletroquímico. É necessário além de ADP para a formação de ATP a presença de Pi, o mesmo é transportado para dentro da matriz mitocondrial. Essa troca é realizada via proteínas de transporte que transportam os radicais fosfato (H2PO-4) para dentro e OH- para fora da matriz mitocondrial, tal troca é eletricamente nula já que tanto o radical fosfato e a hidroxila possuem cargas -1.

Outro exemplo desse processo é o transporte de piruvato do citosol – que é produzido na glicólise – que é mediado por um transportador que troca o piruvato por hidroxila